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应用荧光素酶-ATP法检测活性污泥的生物活性

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简介:

 众所周知,活性污泥工业的处理效率与污泥微生物的活性密切相关。微生物活性越大,处理效果就越好;反之,效果就越差。通常我们使用混合液悬浮固体浓度(MLSS)、混合液挥发悬浮固体浓度(MLVSS)、污泥沉降比(SV)、污泥容积指数(SVI) 、污泥龄(TS) 等指标来衡量微生物活性,并以F/M的形式进行评述。随着研究的深入及测量技术的进步,人们发现用MLSS(或MLVSS) 来衡量活性污泥中微生物的活性不够确切,因为MLSS(或MLVSS) 中也包括了与净化无关的非活性物质在内。即不能将活的细胞与有机残体(如已经死亡的微生物残体) 区分开,用它来作为衡量生物量的指标并不准确。为此,人们开始尝试用脱氢酶活性(DHA)、比耗氧速率(SOUR) 和三磷酸腺苷(ATP) 等生物指标来反映微生物活性。而在这些指标中,ATP广泛存在于生物细胞内,是生物体内能量代谢的重要产物和细胞代谢可利用能量的携带者,并参与生物体内蛋白质、脂肪的生化合成、吸收等反应。所以,通过测定ATP含量的多少,可以直接反映细胞活性、微生物的数量,而且它的测定方法简单快速。将ATP应用于污泥生物活性的检测,已经引起广泛地关注。

原理:

 ATP含量检测可以用吸光度检测、发光检测或同位素等方法实现。传统的吸光度检测法,检测灵敏度低,线性范围窄,难以准确检测ATP状况。而应用荧光素酶发光方法检测ATP,具有*高的灵敏度和*宽的检测范围,而且简便、快速,是目前*为流行的方法。该方法基于萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)催化荧光素氧化,消耗ATP,发出光子的高效发光反应,具有发光效率*高、发光量与ATP含量呈很好的线性关系的特点。

检测方法:

 1.所需器材
  • 专用检测仪
  • 专用检测试剂盒(包含ATP标准品,裂解液,检测液)
  • 活性污泥样品
2. 试验方案

2.1 试剂准备
(1)稀释Lysis Buffer:将Lysis Buffer室温溶化,用无菌水5倍稀释使用。
(2)配制L/L检测液:L/L Buffer室温溶化后,作为稀释液将L/L substrate进行50倍稀释,配制成L/L检测液。
(3)ATP标准品的配制:用Lysis Buffer将ATP标准品进行10倍梯度稀释,制作10-12至10-17mol/μl浓度的ATP标准样品。

2.2 ATP标准曲线
(1)取10-12至10-17mol/μl浓度的ATP标准样品各10μl,分别加入50μl的L/L检测液,混合后放入发光检测仪检测(发光强度RLU)。
(2)根据ATP标准品与相应发光强度制作ATP-RLU标准曲线。

2.3 活性污泥样品检测
(1)抽取一定量的活性污泥,并混合为均匀悬液。
(2)取10μl活性污泥悬液,加入50μl Lysis Buffer,混合均匀,静置5分钟;然后加入50μl L/L检测液,并混合均匀,放入检测仪检测,获得总ATP发光强度。
(3)取10μl活性污泥悬液,加入50μl 纯水,混合均匀,静置5分钟;然后加入50μl L/L检测液,并混合均匀,放入检测仪检测,可获得水中游离ATP发光强度。(通常游离ATP占总ATP的比例小于1%)
(4)将样品发光强度带入标准曲线方程,获得样品中ATP含量。
(5)通过检测不同处理后的活性污泥或不同来源的活性污泥,可获得活性污泥的活性变化。

参考文献:

*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供帮助.
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